METODE – METODE UJI AKTIVITAS PENGHAMBAT ACE SECARA IN VITRO

Terdapat beberapa metode yang digunakan untuk mendeteksi aktivitas inhibisi ACE. Masing-masing metode menggunakan substrat yang berbeda. Cara untuk mengukur produk hasil reaksi enzimatik atau untuk memisahkan substrat dengan produk pun berbeda-beda, diantaranya adalah spektrofotometri, fluorometri, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), elektroforesis, dan radiokimia. Metode uji aktivitas penghambat ACE dibagi berdasarkan penggunaan substrat atau inhibitor target yang dapat dibagi beberapa metode sebagai berikut:

 1. Metode Cushman dan Cheung

Metode Cushman dan Cheung merupakan metode uji aktivitas penghambat ACE menggunakan hipuril-histidil-leusin atau HHL sebagai substrat, dimana HHL ini  akan dihidrolisis oleh ACE menjadi asam hipurat (Gambar 2.)(17).

Gambar 2. Hidrolisis HHL oleh ACE

Asam hipurat tersebut diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 228 nm untuk menggambarkan aktivitas ACE. Bila terdapat penghambat ACE, konsentrasi asam hipurat yang terbentuk akan berkurang(7).

Keberhasilan metode Cushman dan Cheung untuk uji aktvitas penghambat ACE masih tergantung dengan kemampuan memisahkan HA yang terbentuk dari substrat HHL. Sehingga masih diperlukan pendekatan lain untuk memudahkan penggunaan secara maksimal metode ini, antara lain: (a) Menambahan 2,4,6-trikloro-s-triazin (TT) pada campuran sampel yang telah mengandung asam hipurat yang terukur pada panjang 382 nm(9). (b) Menggunakan HEPES untuk menghentikan reaksi dan  Cyanuric chloride dalam 1,4-dioxane sebagai color reagent yag terukur pada fotometri pada panjang 504 nm(18).  (c) Menambahkan o-phthaldialdehyde yang akan bereaksi dengan hasil hidrolisis substrat histidin-leusin yang terukur secara fluorometri eksitasi 365 nm dan emisi 495 nm dengan fluoro-kolorimetri(19). (d) Menggunakan color reagent benzene sulfonyl chloride (BSC) dalam kehadiran quinoline(20) kemudian metode BSC-visibel spektrofotometri dimodifikasi menggunakan mikrotiter plate reader(21).

Selain menggunakan spektrofotometer UV-VIS, KCKT juga dapat digunakan akan tetapi tentu membutuhkan beberapa modifikasi seperti penggunaan shielded hydrophobic phase (SHP) HPLC yang memisahkan HHL dan HA yang diinjeksikan langsung menggunakan spektofotometer panjang gelombang 254 nm dengan 8,0 µl flow-cell(13) tetapi Ahmed, S., et.al mampu mengembangkan metode HPLC yang lebih sederhana(22) yang selanjutnya disempurnakan menggunakan RP-HPLC dan HEPES sebagai buffer(23).

  1. Metode Holmquist

Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Barton Holmquist, et.al., pada tahun 1979 menggunakan FAPGG sebagai substrat. Uji ini didasarkan pada absorpsi pergeseran spektrum biru yang terjadi pada hidrolisis substrat menghasilkan asam amino furanacryloyl-blocked dan dipeptida(10). Diperkuat oleh Lundberg P.A., et.al., melakukan pengukuran aktivitas penghambatan ACE dalam serum menggunakan FAPGG(24).  Metode ini telah dilakukan optimasi dan validasi penggunaan FAPGG sebagai substrat untuk skrining peptida bioaktif(25). Modifikasi penggunaan FAPGG untuk pengukuran aktivitas penghambatan ACE secara in vitro. FAPGG dihidrolisis menjadi FAP dan GG oleh ACE. Pengukuran spektrofotometri ini didasarkan pada perubahan warna menjadi biru pada spektrum serapan yang terjadi saat FAPGG dihidrolisis dan diukur pada panjang gelombang antara 328 dan 352 nm. Reaksi enzimatis lalu dihentikan dengan EDTA(26) dan modifikasi yang lain menggunakan microplate reader(27). Juga telah dilakukan uji ACE inhibitor menggunakan HPLC menggunakan FAPGG dan HHL sebagai subtrat dimana hasil penelitian menunjukan metode HPLC menggunakan substrat FAPGG paling sensitif(28).

  1. Metode Elbl dan Wagner

Metode Elbl dan Wagner menggunakan substrat dansiltriglisin dan menghasilkan produk dansilglisin dan diglisin dengan adanya enzim ACE(12) yang kemudian dimodifikasi dengan menggunakan microtitre plate yang diinjeksikan langsung ke HPLC(15)(29). Oleh Duncan, et.al menyempurnakan metode ini dengan menggunakan dansiltriglisin dan dansilglisin diukur dengan HPLC-UV detector(30) metode ini berdasarkan kemampuan ACE-katalis menghidrolisis dansyltriglisin menjadi dansilglisin dan glisin-glisin (gambar 3)(30).

Gambar 3. Hidrolisis dansiltriglisin oleh ACE

Modifikasi metode Ebl dan Wagner untuk lebih optimal dan akurat dilakukan dengan pemotongan substrat hipuril-glisil-glisin oleh ACE dan reaksi subsekuens dengan asam trinitrobenzesulfonat (TNBS) sehingga terbentuk 2,4,6–trinitrofenil-glisil-glisin (TNP–gly-gly) yang diukur dengan RP-HPLC(31)(32). Selain itu juga telah dilakukan validasi colorimetric assay untuk skrining ACE inhibitor dari ekstrak tumbuhan secara in vitro menggunakan metode Elbl & Wagner(33).

  1. Metode Baudin

Baudin (1990) telah mengembangkan suatu metode dengan teknologi radiometri untuk mengukur aktivitas ACE pada urin dan menggunakan substrat yang telah ditandai yaitu, benzoil-[l-14C]glicil-L-histidil-L-leusin. Substrat tersebut akan diputus pada ikatan glisin-histidil dan membentuk benzoil-[l-14C]glisin. Metode uji ini dapat digunakan pada studi mengenai ACE pada urin sebagai penanda bila terdapat kerusakan pada ginjal(11). Namun, metode ini belum banyak/ada jurnal menggunakan metode ini untuk uji aktivitas penghambat ACE, mengingat pembuatan substrat yang digunakan tergolong cukup sulit.

  1. Metode Carmel dan Yaron

Metode Carmel dan Yaron mulai ditemukan dan dikembangkan tahun 1978, suatu metode pengukuran aktivitas penghambatan ACE dengan menggunakan substrat o-aminobenzoilglisil-p-nitrofenilalanilprolin yang kemudian dihidrolisis menjadi o-aminobenzoilglisil. Hasil hidrolisis tersebut yang merupakan senyawa fluoresensi. Untuk menghentikan reaksi enzimatis, digunakan EDTA(8). Pada tahun 2006, Sentandreu dan Toldra kemudian menggunakan metode Carmel dan Yaron dengan sedikit modifikasi yaitu diukur dengan multi-scan microplate fluorometer. Keuntungan metode ini adalah kapasitas penggunaan sampel yang banyak dan dalam waktu yang sebentar(34). Metode ini juga masih belum banyak digunakan.

  1. Metode LAM

Metode LAM mulai dikembang pada tahun 2007, adalah Le Hoang Lam, dkk., berhasil menemukan subsrat baru yaitu 3-hydroxybutyrylglycyl-glycyl-glycine (3HB-GGG) untuk uji aktivitas penghambat ACE, dengan adanya aktivitas ACE dan Aminocylase, 3HB-GGG dipecah menjadi asam amino (Gly- Gly-gly) dan asam 3-hidroksibutirat (3HB). 3HB diukur menggunakan F-kit. Metode ini lebih sensitif, akurat, cepat dan sesuai dengan metode konvensional(16), metode ini dikembangkan dengan menggunakan Water-Soluble Tetrazolium Salt (WST 1) untuk mendeteksi 3-hidroksibutirat yang terbentuk(35), untuk prinsip uji aktivitas penghambat ACE menggunakan ACE kit-wst1 dapat dilihat pada gambar 4., dan menggunakan Flow Injection Analysis(36) agar dapat mendeteksi langsung secara cepat, sederhana, dan akurat. Enzim ini telah dibuat dalam bentuk kit yang telah dipatenkan dengan nama ACE kit-WST1. Metode LAM dengan substrat 3HB-GGG menggunakan ACE kit-wst1 dapat juga diaplikasikan menggunakan mikroplate elisa reader(37)(38)(39) sehingga pengujian dapat dilakukan sangat sederhana, mudah, cepat, dan akurat.

Gambar 4. Prinsip uji aktivitas penghambat ACE menggunakan ACE kit-wst1

Be Sociable, Share!

Be the first to comment

Leave a Reply

Your email address will not be published.


*